好儿子妈妈是你一个人的装睡,亚州一区二区三区四区在线视频,欧美日本视频日本一区二区,中文字幕码在线电影二区

您好,歡迎進入河南榮程聯(lián)合科技有限公司網(wǎng)站!
產(chǎn)品列表

—— PROUCTS LIST

技術(shù)文章Article 當前位置:首頁 > 技術(shù)文章 > 徠卡顯微鏡的活細胞成像技術(shù)

徠卡顯微鏡的活細胞成像技術(shù)

點擊次數(shù):813 更新時間:2023-06-09

了解復(fù)雜且快速變化的細胞動力學(xué)是深入探索生物進程的重要一步。因此,現(xiàn)代生命科學(xué)研究越來越需要關(guān)注于在分子水平上實時發(fā)生的生理事件。

圖片 1.png

 
 
觀察和分析活細胞時面臨的挑戰(zhàn)
在固定細胞或組織中,獲取樣品“分子狀態(tài)"的信息已是一項艱巨的任務(wù)。如果需要獲取實時信息,,就必須盡可能在實驗過程中保證細胞自然地運行生理機制,因此將加大實驗的困難程度。此外,由于很多生理過程的持續(xù)時間僅有幾秒甚至幾毫秒(例如細胞內(nèi)離子水平的變化),必須在相對較短的時間內(nèi)采集大量信息。
滿足這些挑戰(zhàn)性需求的一種方法是采用被統(tǒng)稱為活細胞成像的光學(xué)技術(shù)。活細胞成像可研究活細胞中的實時動態(tài)生理過程,而非提供細胞當前狀態(tài)的一幅“快照"。它把快照轉(zhuǎn)變成了電影。活細胞成像可提供單個細胞、細胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)(原位)甚至整個生物體(體內(nèi))中動態(tài)發(fā)生分子事件的空間和時間信息。這些特性讓活細胞成像成為了研究細胞生物學(xué)、癌癥、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)科學(xué)中動態(tài)生理過程的必要技術(shù)。
近年來,電子學(xué)、光學(xué)和生物化學(xué)的迅速發(fā)展,使得科學(xué)家們更輕松的實現(xiàn)活細胞成像。如今的活細胞成像方法使用優(yōu)化的顯微鏡、專用光源、高速相機、高靈敏度探測器和特異性的熒光標記物,可同時提供技術(shù)成熟且仍具有創(chuàng)新性的全套解決方案,滿足在分子水平上對單細胞或整個細胞網(wǎng)絡(luò)進行實時研究的挑戰(zhàn)性需求。
使用線粒體標記物(MitoRed®)和熒光鈣染料(Fluo-4)對細胞進行活細胞成像

圖片 2.png

 
圖1:熒光鈣染料Fluo-4標記的睪丸支持細胞的原代培養(yǎng)。鈣染料的位置類似于表征細胞內(nèi)的鈣分布。

圖片 3.png

 
圖2:線粒體標記物MitoRed®染色的睪丸支持細胞的原代培養(yǎng)。

圖片 4.png

 
圖3:圖1和圖2的疊加。觀察鈣斑和線粒體的共定位情況。

圖片 5.png

 
圖4:睪丸支持細胞的DIC圖像。
 
使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP5(DMI6000 CFS)和Leica LAS AF7000成像軟件獲取的圖像。由德國亞琛工業(yè)大學(xué)生物II研究所化學(xué)感知系Sophie Veitinger博士提供。(地址:德國馬爾堡菲利普斯大學(xué)細胞生物學(xué)和細胞病理學(xué)研究所)
對應(yīng)刊物(非圖片來源):
 
活細胞成像中的常見問題
活細胞成像通常適用于培養(yǎng)的細胞系(例如HEK細胞、HeLa細胞)、原代細胞(例如皮膚細胞、神經(jīng)細胞)、急性制備的組織切片(例如腦切片)或整個器官或生物體。因為細胞被帶出其原本“自然"的培養(yǎng)環(huán)境并會受到光毒性的影響,所以在實驗過程中的首要任務(wù)是保持細胞的健康狀態(tài)。
 
細胞外溶液
不同類型的人工細胞外溶液(林格氏液、人工腦脊液(ACSF))和培養(yǎng)基(例如Leibovitz L-15)用于為細胞提供維持其生理功能所必需離子和其他輔助因子。用于活細胞成像的培養(yǎng)基成分包括從極簡單的“含鹽"溶液(例如林格氏液)到非常復(fù)雜的混合物(例如Leibovitz L-15),種類繁多。
但所有溶液都有一個共同點,即都包含pH緩沖液,因為暴露在環(huán)境中之后,會顯著改變培養(yǎng)的pH(通常pH 7.2.-7.4)。在很多細胞外溶液中,pH緩沖液通過添加10–20 mM兩性離子有機化學(xué)品HEPES(2-[4-1-基]乙磺酸)來實現(xiàn)。但對于很多細胞來說,細胞外溶液不能用HEPES或其他化學(xué)緩沖液(例如MOPS、TES),因為培養(yǎng)基中缺乏pH緩沖碳酸氫鹽會對細胞造成傷害。要解決該問題,必須將二氧化碳輸送到細胞外溶液中(二氧化碳與細胞外溶液接觸時,會轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽)。這可以通過兩種方式實現(xiàn):一種是不斷輸送氣態(tài)二氧化碳(通常以碳化物的形式:95%的氧氣和5%的二氧化碳)到細胞外溶液中,并不斷對細胞進行換液。這種方法通常用于代謝周轉(zhuǎn)率高于細胞增殖的切片制備。
另一種常見的方法是將細胞保存在可調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境氣體濃度和溫度(在很多情況下)的培養(yǎng)室中。在此類培養(yǎng)物中持續(xù)供應(yīng)5-7%的二氧化碳氣體,并且可以嚴格控制溫度。必須根據(jù)使用的樣品類型和實驗的持續(xù)時間,來確定化學(xué)緩沖的細胞外溶液是否足以使細胞保持良好狀態(tài),或者是否需要輸送二氧化碳甚至使用培養(yǎng)小室。在很多情況下,化學(xué)緩沖溶液即可滿足細胞培養(yǎng)和短時實驗的要求。,因為急性切片代謝周轉(zhuǎn)率要高得多,通常需要足夠的二氧化碳供應(yīng)。但對于很多細胞類型和長時間成像實驗,必須使用培養(yǎng)小室。
 
光毒性
使用熒光染料進行活細胞成像的另一個問題是:激光或高強度電弧放電燈的入射光會損害細胞,即所謂的光毒性。光毒性主要在合成熒光染料被激發(fā)時發(fā)生。熒光染料被激發(fā)后,它們將與分子氧發(fā)生反應(yīng)并產(chǎn)生自由基。為避免光毒性,必須選擇盡可能低的光強度和盡可能短的激發(fā)持續(xù)時間,以將入射高能光劑量保持在盡可能低的水平。在實驗設(shè)計過程中,還必須考慮實驗的持續(xù)時間。長時間實驗中,通常不需要高幀速率。因此,圖像采集的周期頻率通??梢詮睦缑棵?0多幀降低到每秒1幀甚至更低。這將顯著降低樣品上的入射光劑量,從而大幅降低光毒性。
對于低強度熒光信號成像,可以考慮更改圖像采集條件設(shè)置,比如在大多數(shù)情況下,通過將相機功能用作像素合并或提高增益,甚至使用特殊的高靈敏度相機(例如EM-CCD相機)進行成像。這樣可以在不增加激發(fā)持續(xù)時間或光強度的情況下實現(xiàn)更好的信噪比和信號質(zhì)量,而這兩者都會導(dǎo)致更高的光毒性。此外,選擇具有長激發(fā)波長的熒光基團也可降低光毒性,因為與具有短激發(fā)波長的熒光基團相比,傳遞給樣品的能量更低。熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白(GFP))的光敏位點位于被多肽包膜覆蓋的蛋白質(zhì)內(nèi)部,因此通常沒有光毒性。
 
漂移
此外,在長時間的活細胞成像實驗中,很可能發(fā)生焦面漂移的問題,,??梢允褂门鋫溆熊浖蛴布刂谱詣訉沟某上駜x器來避免這種情況。

圖片 6.png

 
圖5:接種了豇豆花葉病毒(CPMV)的豇豆初生葉(Vigna unguiculata "California Blackeye"),在病毒RNA 2中的運動蛋白(MP)和衣殼蛋白(CP)之間的插入GFP基因。GFP以游離蛋白的形式大量表達(因此未融合于MP或CP),并且可以定位在受感染的表皮和葉肉細胞的細胞質(zhì)和細胞核中。由荷蘭瓦赫寧根農(nóng)業(yè)大學(xué),生物分子科學(xué)部門分子生物學(xué)實驗室的Joan Wellink博士及植物科學(xué)部門病毒學(xué)實驗室的Jan van Lent博士提供。
 

圖片 1.png

 
視頻1:用DIOC6染色的活洋蔥球細胞,同時進行透射光檢測;使用共聚焦顯微鏡Leica TCS SP2 AOBS RS拍攝,63倍物鏡,1.5倍變焦,2倍線平均,掃描分辨率512 x 265,速度每秒4.7幀。

圖片 2.png

 
視頻2:用表達GFP融合蛋白的構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染的COS細胞。細胞溶質(zhì)蛋白在細胞中呈針狀分布。3D堆棧(10.14 µm,14層切)每5秒記錄一次,,持續(xù)10分鐘。本視頻使用了堆棧的最大投影。512 x 512像素,雙向掃描,變焦2倍,物鏡HCX APO L U-V-I 63.0 x 0.90 W UV。由法國伊爾基希細胞生物學(xué)研究所成像中心Jocelyn Laporte,提供。
 
用于活細胞成像的方法
可應(yīng)用于活細胞成像的寬場和共聚焦顯微技術(shù)的范圍也非常廣泛。通常,使用復(fù)式顯微鏡和反差對比方法(例如相差和微分干涉相差(DIC)),隨時間觀察細胞的生長、聚集或運動過程。此外,通常使用體視顯微鏡或宏觀鏡對大型標本(例如發(fā)育中的斑馬魚胚胎)進行延時成像。在過去數(shù)十年中,先進熒光技術(shù)變得越來越重要。共聚焦顯微鏡應(yīng)用的迅速增加,使生物研究的視角從平面向三維立體轉(zhuǎn)變。



版權(quán)所有 © 2024 河南榮程聯(lián)合科技有限公司  ICP備案號:豫ICP備15032798號-1