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【THUNDER小課堂】高對(duì)比度快速成像
對(duì)小鼠肺組織進(jìn)行高對(duì)比度快速成像，可以對(duì)肺血管系統(tǒng)的內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)和支持細(xì)胞進(jìn)行可視化研究。
本文介紹了在小鼠肺標(biāo)本中如何利用THUNDER Imager 3D Cell Culture熒光顯微鏡和即時(shí)光學(xué)解析（ICC）技術(shù)有效地研究控制肺血管形成和維持的細(xì)胞和分子機(jī)制，以及當(dāng)肺血管疾病發(fā)生時(shí)出現(xiàn)的相應(yīng)問(wèn)題。肺血管系統(tǒng)是由內(nèi)皮細(xì)胞組成的分支管狀網(wǎng)絡(luò)，這些內(nèi)皮細(xì)胞排列在血管上，和支持細(xì)胞構(gòu)成了血管壁。
從健康角度來(lái)看，識(shí)別在肺動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管發(fā)育過(guò)程中形成肺血管的細(xì)胞群類型是很有趣的，有助于它們的維持和修復(fù)，以及研究這些細(xì)胞的行為和調(diào)控信號(hào)。
小鼠肺組織圖像：（左）原始寬場(chǎng)圖像和（右）使用Instant Computational Clearing（ICC）技術(shù)后的THUNDER高清圖像。圖片來(lái)源：美國(guó)加利福尼亞州Ross Metzger博士。
簡(jiǎn) 介
肺血管疾病的研究涉及多種方法來(lái)探索影響疾病的細(xì)胞和分子程序[1，2]。肺血管從胚胎期開(kāi)始發(fā)育，并在出生后繼續(xù)。肺的支管網(wǎng)絡(luò)由內(nèi)皮細(xì)胞和支持細(xì)胞組成。為了更好地了解血管疾病，科學(xué)家研究了形成肺血管的細(xì)胞，以及那些有助于血管修復(fù)的細(xì)胞[1，2]。
由于管狀結(jié)構(gòu)，以及肺標(biāo)本很容易有數(shù)百微米厚，因此可視化內(nèi)皮細(xì)胞和支持細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的發(fā)育以及血管系統(tǒng)的維持jiju挑戰(zhàn)。此處的報(bào)告結(jié)果展示了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture顯微鏡，在小鼠肺組織中有效研究肺血管疾病的機(jī)制[3，4]。
挑 戰(zhàn)
在肺組織成像時(shí)想要獲得真實(shí)結(jié)果，擁有一種可以快速獲取高對(duì)比度三維圖像的解決方案非常關(guān)鍵，確保其中的重要細(xì)節(jié)得到清晰呈現(xiàn)。傳統(tǒng)的寬場(chǎng)顯微鏡能夠?qū)@些厚標(biāo)本的大面積成像，這種顯微鏡速度快，檢測(cè)靈敏度高，但由于非焦信號(hào)的干擾，圖像模糊，對(duì)比度顯著降低[3，4]。
方 法
使用THUNDER Imager 3D Cell Culture顯微鏡對(duì)小鼠肺部標(biāo)本進(jìn)行成像。使用FITC、Cy3以及Alexa 633對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫染色。為了可視化整個(gè)肺組織標(biāo)本，使用20x Plan Fluo Apo 0.4 NA（數(shù)值孔徑）物鏡以及三個(gè)熒光通道。為覆蓋280µm厚度的樣品，采集的圖像顯示為由115層光學(xué)切片組成的擴(kuò)展景深（EDoF）投影。
結(jié) 果
THUNDER Imager 3D Cell Culture可以快速獲取肺組織的三維圖像，然后通過(guò)Instant Computational Clearing（ICC）技術(shù)去除寬場(chǎng)圖像中會(huì)降低對(duì)比度的模糊信號(hào)（參見(jiàn)圖1）[3，4]。ICC可以呈現(xiàn)肺組織圖像中的精細(xì)結(jié)構(gòu)和細(xì)胞水平分辨率，以研究影響肺血管疾病的發(fā)育、維持和修復(fù)活動(dòng)[1，2]。
整個(gè)組織圖像采集時(shí)間約1min（參見(jiàn)圖1）。
圖1：小鼠肺組織標(biāo)本的擴(kuò)展景深（EDoF）投影：A) 原始寬場(chǎng)圖像，B) Instant Computational Clearing（ICC）后的高清圖像。
圖片來(lái)源：美國(guó)加利福尼亞州Ross Metzger博士。
結(jié)
論
使用THUNDER Imager顯微鏡的Instant Computational Clearing（ICC）技術(shù)[3，4]可以對(duì)小鼠肺血管疾病相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制進(jìn)行有效研究。因?yàn)榕c傳統(tǒng)的寬場(chǎng)成像相比，該技術(shù)顯著提高了圖像對(duì)比度。
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1.L.C. Steffes, A.A. Froistad, A. Andruska, M. Boehm, M. McGlynn, F. Zhang, W. Zhang, D. Hou, X. Tian, L. Miquerol, K. Nadeau, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, M.E. Kumar, A Notch3-Marked Subpopulation of Vascular Smooth Muscle Cells Is the Cell of Origin for Occlusive Pulmonary Vascular Lesions, Circulation (2020) vol. 142, no. 16, pp. 1545–1561, DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.045750.
2.M. Boehm, X. Tian, Y. Mao, K. Ichimura, M.J Dufva, K. Ali, S. Dannewitz Prosseda, Y. Shi, K. Kuramoto, S. Reddy, V.O. Kheyfets, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, Delineating the molecular and histological events that govern right ventricular recovery using a novel mouse model of pulmonary artery de-banding, Cardiovascular Research (2019) vol. 116, iss. 10, pp. 1700–1709, DOI: 10.1093/cvr/cvz310.
3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems.
4.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.
