徠卡超薄切片技術(shù)介紹

點擊次數(shù)：908 更新時間：2022-04-29

對樣本開展研究時，為了以納米級分辨率顯示其精細結(jié)構(gòu)，通常會使用到電子顯微鏡。

電子顯微鏡有兩種類型：掃描電子顯微鏡（SEM）用于對樣本表面成像，以及需要使用極薄電子透明樣本的透射電子顯微鏡（TEM）。因此，使用電子顯微鏡對樣本內(nèi)部的精細結(jié)構(gòu)進行成像時，此類技術(shù)解決方案需要制作出非常薄的樣本切片。被稱為超薄切片技術(shù)的樣本制備方法可以產(chǎn)生具有最小假象的超薄切片（厚度20-150nm）。

在切片過程中，樣本的塊面（切割切片處）始終保持在一個平直的表面上，可供SEM進行研究。當截面在陣列中成像時，就可以重建樣本的三維圖像。這種方法稱為陣列斷層掃描（AT）。超薄切片技術(shù)及其在AT中的應(yīng)用概述如下。

超薄切片技術(shù)

超薄切片技術(shù)主要用作透射電子顯微鏡（TEM）的樣本制備方法。它允許樣本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)以納米級分辨率進行可視化和分析。它以快速、干凈的方式制作超薄的樣本切片。超薄切片技術(shù)的一個主要優(yōu)點是切片內(nèi)電子透明區(qū)域的大小和均勻性以及切片產(chǎn)生的速度。

超薄切片技術(shù)可用于多種類型的樣本，包括生物學(xué)試樣和工業(yè)材料如聚合物（橡膠和塑料）以及韌性、硬質(zhì)或脆性材料（金屬或陶瓷）等。制備這些樣本薄片還有其他技術(shù)，如聚焦離子束（FIB）銑削、離子刻蝕、三腳架拋光和電化學(xué)處理，但超薄切片技術(shù)在速度和清潔度方面具有優(yōu)勢。

陣列斷層掃描 (AT) 是一種用于細胞和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的高分辨率三維圖像重建方法。該技術(shù)利用掃描電子顯微鏡（SEM）或光學(xué)顯微鏡（LM）中超薄、樹脂包埋連續(xù)切片的有序陣列成像。AT技術(shù)能夠?qū)毎暗鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)開展定量立體結(jié)構(gòu)分析和可視化觀察。其橫向和空間分辨率比傳統(tǒng)的共焦顯微鏡更理想。此外，通過生物試樣的部分自動化檢測來實現(xiàn)更高的處理量。

超薄切片原理

利用陣列斷層掃描進行TEM觀察以及實現(xiàn)優(yōu)化3D重建時，超薄有序的切片是一大前提。超薄切片機（如徠卡顯微系統(tǒng)的EM UC7）則可以制作出此類超薄的樣本切片（厚度20 ~ 150 nm）。

要在透射電子顯微鏡中形成樣本的圖像，電子必須在不出現(xiàn)任何重大速度損失的情況下穿透樣本。樣本對電子輻射的滲透率部分取決于其質(zhì)量和厚度（厚度×密度），部分取決于電子顯微鏡的加速電壓。被試樣吸收的電子會導(dǎo)致熱量積聚，從而在物體中形成假象。

圖1：顯示超薄切片機樣品臂、刀座和水槽式玻璃刀的側(cè)視圖。

使用超薄切片機進行切片時，需將樣本插入安裝在特殊軸承上的樣品臂當中，由該軸承執(zhí)行垂直切割運動。切割截面并縮回試樣支臂后，極其準確的機電進給將試樣稍微向前移動，移動距離與所需截面厚度相對應(yīng)。通過將試樣垂直移動到固定玻璃刀或金剛石刀的鋒利刀片上進行切片。由于切片過薄，直接從刀片上取下切片很困難。

因此，它們是在切片程序后從水槽中水面上收集的（或在冷凍切片的情況下借助顯微操作器）。在用電子顯微鏡（EM）檢查之前，可能需要做任何進一步的準備。

陣列斷層掃描的試樣制備

為AT制備生物學(xué)軟試樣時需要完成若干步驟的操作。這些步驟包括：